研究设计、参与者与审批

本前瞻性队列研究招募了加拿大安大略省两家成人省级烧伤中心的烧伤患者：2022年1月1日至7月31日期间，在安大略省多伦多Sunnybrook健康科学中心的Ross Tilley烧伤中心，以及2023年1月1日至7月31日在加拿大安大略省汉密尔顿健康科学中心的烧伤科。 2024年。通过医院发布的研究相关广告，从两地招募了18岁及以上、无重大健康问题且未烧伤的健康志愿者作为对照组。本研究获得了桑尼布鲁克健康科学中心研究伦理委员会（#194-2010）和汉密尔顿综合研究伦理委员会（#15833）的批准。纳入研究前，参与者已获得书面知情同意，进行前瞻性采血。

烧伤患者根据以下纳入标准选拔：≥18岁，≥2%全身表面积（TBSA），且至少需要一次与烧伤相关的手术来控制伤情。因重建和冻伤入院的患者被排除。所有患者均根据既定临床方案接受标准治疗，包括早期切除和移植、早期营养干预、充足抗生素覆盖以及必要时的通气。在住院期间及住院期间每周最多采集两次烧伤患者全血样本，同时进行临床血液采集。健康志愿者提供了一次性全血捐献。

临床结局

烧伤团队（包括主治医生和重症监护人员）对患者人口统计和临床结局进行了前瞻性记录。这些包括人口统计数据、损伤特征、烧伤大小、吸入损伤、入院前共病、院内死亡率、器官衰竭、肺炎和败血症，均由ABA指南定义[30]。修订版Baux评分为每位患者计算，定义如下[31]。住院时长（LOS）以入院至烧伤病房出院之间的天数计算。

动物与热损伤模型

动物实验按照麦克马斯特大学动物研究伦理委员会（AREB）（加拿大安大略省汉密尔顿;AUP#22-08-30）。从缅因州巴港的杰克逊实验室购买了雄性野生型C57BL/6J小鼠，饲养环境为常温，并按照《实验动物护理与使用指南》进行照料。这些老鼠年龄为75周（n = 11只）。环境温度为21°C，有12小时的光暗循环，食物和水是自由供应的。烧伤前，通过EDTA涂层毛细血管采集全血。随后，所有小鼠均用2.5%异氟醚麻醉，并沿背脊区域刮毛。所有小鼠在背部皮下注射2毫升乳酸以保护脊柱，腹腔内注射0.5毫升以进行复苏。布洛芬啡（0.05-0.1 mg/kg体重）用于疼痛管理。通过将小鼠背部浸入98摄氏度的水中10秒，形成了覆盖TBSA20%的全层三度灼烧伤。烧伤的小鼠随后被单独关进无菌笼子，食物和水则是自由提供的。实验室工作人员每日对所有受伤啮齿动物进行健康评分，以减少动物的痛苦和痛苦。健康评分基于15分制，眼睛和鼻子、活动量、食物摄入、梳理和水分摄入最多可得3分。受伤七天后，小鼠被安乐死，全血采集并储存在-80摄氏度，等待进一步分析（见图5A）。

烧伤患者的生物年龄DNA鉴定和表观遗传时钟

根据制造商的协议，使用Qiagen DNeasy血液套件从全血中提取DNA。为了高效检测衰老的表观遗传特征，DNA样本在定制的靶向甲基化阵列上进行了测试。通过系统查询表观遗传数据库（EWAS catalogue 和 datahub）以及大型（N>1000）表观基因组范围关联研究（EWAS）文献，构建了~50,000个与年龄相关性状强有力关联的 CpG 位点，构建成定制的 Illumina Infinium 甲基化阵列。原始甲基化数据（idats）通过 Sesame 软件包中的 OpenSesame 管道转换为 beta 值（openSesame：Sesame 中的 openSesame 管道：分析 Illumina Infinium DNA 甲基化阵列的工具）。该函数执行正向指数带外（NOOB）校正、非线性染料偏置校正以及带外阵列杂化（pOOBAH）的P值评估，P值阈值为0.05。为确保探针和样本质量，对缺失数据进行了逐步过滤，在探针和样本之间交替进行，阈值逐渐提高，分别为20%、10%和5%。表观遗传性别的分配基于X染色体和Y染色体探针间中位甲基化水平的比例。表观遗传性别与报告性别不一致或表观遗传性别不确定的样本被排除在分析之外。利用Illumina预设对照计算了亚硫酸氢盐转化、杂交、延伸和染料特异性的质量控制指标。在推荐阈值下未通过两项或以上测试的样本被排除在分析之外。

衍生出多种生物钟，包括训练于（i）按年龄（HorvathAge）[32]训练的，（ii）死亡率（GrimAge;通过测量与死亡相关蛋白水平的甲基化代理来预测死亡时间）[33]，（iii）功能能力或“健康寿命”（PhenoAge;基于临床标志和合并症，估计表型年龄）[6]，以及（iv）基于年龄相关蛋白质生物标志物纵向变化捕捉衰老轨迹（区别于此前的生物年龄“快照”）（但尼丁（P）ace（o）f（A）ging（m）乙化;预测一年内身体和认知特征年龄相关变化的速率）[34]。虚弱甲基化风险评分（MRS）基于Li等（2022）[35]的20-CpG标记评分推导。死亡率MRS基于Huan等（2022）[36]的177 CpG评分推导。MRS被标准化为均值为0，标准差为1。

烧伤表型与烧伤患者DNA甲基化之间的关联检测

由于多名患者在烧伤后多个时间点（0-4天、5-14天、15-27天和28+天）采集和检测血液，因此以表观遗传推断性状的平均值作为每位参与者的代表值。通过线性回归评估了烧伤表型（状态、严重程度）与表观遗传推断性状（DNAmclocks、MRS）之间的关联。烧伤表型被视为主要自变量，表观遗传推断的特征为因变量。所有回归分析均以年龄和性别作为协变量进行时间调整，除按性别或年龄层分层分析外。关联测试在R 4.3.2版本（奥地利维也纳统计计算基金会）中进行。

烧伤小鼠生物年龄和表观遗传时钟的DNAm分析

从烧伤前后7天采集的小鼠全血样本中提取了DNA。DNA经过亚硫酸氢转化，并利用Illumina Infinium鼠标甲基化珠片对>285,000个CpG甲基化标记进行了分析。小鼠甲基化数据使用Sesame R软件包预处理，参数根据Zhou等人针对小鼠的建议进行配置）[37]. 进一步进行了质量控制，去除了CpG探针和低检测率样品（<90%探针和样本呼叫率）。从小鼠甲基化阵列数据中，我们利用ClockBase[40]推导出多组织（Thompson等，2018）[38]和肝脏特异性（Wang等，2017）[39]小鼠时钟。

统计分析

数据报告依据《加强流行病学观察性研究报告》（STROBE）声明[41]。人口统计数据采用了学生t检验、曼-惠特尼U检验和费舍尔精确检验（视情况而定）进行分析。使用Kruskal-Wallis检验进行了时间点分析。异质性测试采用了Cochran Q法。患者测试中，所有测试均为双尾，P<0.05被认为具有统计学显著性。小鼠结果采用单尾学生t检验分析，P<0.05被认为具有统计学显著性。分析使用SPSS Statistics 29.0版（IBM公司，纽约阿蒙克）、GraphPad Prism 10.0.0（GraphPad Software，马萨诸塞州波士顿）和R 4.3.2版本完成。图形使用GraphPad Prism版本10.0.0和R版本4.3.2生成。

研究人群特征与结果

为了研究烧伤对表观遗传衰老的影响，我们对从烧伤患者和健康个体采集的全血进行了DNA甲基化研究。研究期间，59名烧伤患者和25名健康对照组被确认符合条件并纳入最终分析。表1描述了研究人群的基线特征。烧伤患者在年龄方面与健康个体无显著差异，平均标准差分别为48.6岁（16.76）和41.36（19.11）岁（P=0.12）。烧伤组（22.4（19.9-26.1））和对照组（19.8（18.4-22.3））之间的身体质量指数（BMI）也相似（P=0.08），尽管烧伤组入院体重（kg）增加（76.5（66.2-92.4）对69.0（60.0-79.0）;P=0.046）。烧伤组男性比例更高（63%对28%;P=0.004）。

在损伤特征方面，大多数（59%）的烧伤患者经历了火焰相关伤害，16%在入院时出现了吸入性损伤。中位数（IQR）燃烧量为9.0%（4.0-20.0）TBSA，中位数（IQR）为5.0%（0.0-16.4）全厚。关于临床结局评估，中位LOS为16.5天（10.0-30.0）天，入院后30天死亡率为2%。院内败血症和肺炎的发生率分别为9%和12%。

烧伤加速表观遗传衰老，DNAm时钟显示，这种效应在患者中持续存在

我们最初通过利用训练用于测量健康寿命和生命的第二代和第三代表观遗传时钟（GrimAge、PhenoAge和DunedinPoAm）以及训练用于预测年龄的第一代Horvath时钟，计算其DNAm年龄，评估了烧伤患者和健康对照组全血中的表观遗传生物衰老。三座钟——霍瓦斯时代（R2=0.90;P=1.49×10-43），GrimAge（R2=0.84;p=8.28×10-35），以及表龄（R2=0.82;P=2.24×10-32）显示与烧伤患者及健康对照组的年龄有强相关性，作为可靠的阳性对照，并确认甲基化评分的合理推导（补充图1）。

与健康对照组相比，烧伤患者表现出显著的表观遗传年龄加速，相当于3.21 HorvathAge年（95% CI，1.00-5.43;P= 5.72×10-3），7.06 GrimAge年（95% CI，4.51-9.63;P= 6.40×10-7），8.75表龄年份（95%置信区间，5.25-12.25;P= 5.04×10-6），且根据DunedinPoAm确定的衰老速度增加了1.32个标准差（SD）（95% CI，0.93-1.71;P= 4.11×10-9）（图1A）。值得注意的是，从烧伤后早期（0-4天;+6.29 GrimAge年）起，表观遗传加速现象依然存在（0-4天;+6.29 GrimAge年;PGrim年龄=0.02，+9.74表龄年;P表龄=5.70×10-3，以及+1.18个但尼丁PoAm SDs;P但尼丁邮政 < 0.0001）一直到后续时间点（28+天;+10.08 阴暗年;P·格林年龄<0.0001，+12.99表龄年;P表龄= 2.0×10-4，以及+2.11个但尼丁PoAm SDs;PDunedinPoAm < 0.0001），表明该效应也是慢性的（见图1B-D）。这些发现综合显示，烧伤会加速表观遗传的生物衰老，且不依赖于年龄和性别，且这种效应至少持续28天。

烧伤后观察到的加速表观遗传衰老与患者烧伤大小高度相关

接着，我们分析了烧伤严重程度与表观遗传衰老的关联。一般来说，影响成人TBSA≥20%的烧伤被归类为严重损伤，通常需要住院治疗和长期康复[17]。研究表明，与轻微烧伤相比，严重烧伤患者面临的结局明显更糟，包括恢复时间延长、感染易感性增加，以及器官衰竭等并发症的风险增加，主要由于严重且持久的高代谢反应，且在受伤后多年持续[17， 18， 20].因此，我们假设烧伤对加速衰老的影响取决于烧伤大小。为测试此结果，我们将患者分层为两组：烧伤覆盖<20%TBSA（N烧伤=44;N控制=25）以及燃烧覆盖≥20% TBSA（N燃烧=15;N控制=25）。两个亚组在年龄、性别、BMI、吸入损伤、30天死亡率或败血症方面无差异（补充表1）。然而，较大烧伤组的修订Baux评分（P<0.001）较高，肺炎发病率较高（P=0.012），这也是TBSA较高烧伤的预期结局（补充表1）。

调整性别和年龄作为协变量后，烧伤较小的患者表现出表观遗传年龄加速2.77 HorvathAge年（95% CI，0.55-4.99;P= 1.71×10-2），5.01 阴郁年龄年（95% CI，2.77-7.27;P= 4.55×10-5），7.13表龄年（95% CI，3.54-10.72;P= 2.34×10-4），以及1.00 DunedinPoAm SD（95% CI，0.65-1.35;P= 3.59×10-7）（图2A）。烧伤较大的患者表现出表观遗传年龄加速4.66 HorvathAge年（95% CI，1.18-8.15;P= 1.28×10-2），13.42 阴郁年龄年（95% CI，10.71.0-16.13;P= 1.39×10-11），14.29 表龄年份（95% CI，10.51-18.08;P= 9.71×10-9），以及2.36名但尼丁邮政亚美利坚标准犬（95% CI，1.97-2.75;P= 6.53×10-14）（图2B）。与我们的假设一致，烧伤较大的患者的表观遗传加速几乎增加了2到3倍。事实上，轻度烧伤患者与重度烧伤患者在GrimAge（P=2.93×10-6）、表龄（P=7.16×10-3）和DunedinPoAm（P=4.01×10-7）之间存在显著异质性，表明结果的显著变异性归因于TBSA的差异（图3A-B）。HorvathAge（P=0.37）未报告异质性。

进一步支持烧伤作为衰老加速因素的直接作用，烧伤的严重程度与年龄加速的幅度成正比（见图2D-F）。事实上，我们观察到，TBSA每增加5%，表观遗传年龄加速0.94 GrimAge年，即~11个月（95% CI，0.55-1.33;P= 1.86×10-5），1.06 表龄年，或 ~13 个月（95% 置信区间，0.49-1.63;P= 5.79×10-4），以及0.14名但尼丁邮政事务部SD（95%置信区间，0.08-0.20;P= 1.80×10-5）（图2C）。霍瓦斯年龄（+0.10年;95%置信区间，-0.24-0.45;P=0.55）显示每增加5%TBSA时无变化。总体而言，我们的数据显示，表观遗传年龄加速的剂量依赖性增加，取决于烧伤的严重程度。

烧伤加速患者在不同生理性别和年龄组的表观遗传衰老

在确立烧伤严重程度与表观遗传衰老之间的明确关联后，我们评估了年龄和性别这两个已知的因伤致死和残疾的风险因素，对烧伤后表观遗传衰老加速的影响。为此，我们将烧伤患者和健康对照组按年龄分层为两组：年轻成人为<47岁（烧伤=27岁;N对照=15）和≥老年人的47年（Nburn=32;N控制=10），并调整性别作为协变量。此年龄分界线的设立旨在确保两组均有足够的样本量以保持足够的统计功效。研究还基于一项先前研究，显示烧伤后压力反应在50岁及以上人群中趋于减弱，而无法形成适当压力反应与死亡率上升有关[42]。这两个亚组在性别、BMI、TBSA或吸入损伤方面无显著差异，30天死亡率、肺炎和败血症也相似（补充表2）。随后，我们将患者按性别分为两组：男性（N烧伤=30;N对照=7）和雌性（N烧=22;N控制=18），并作为协变量调整了年龄。男性与女性之间的相关人口统计信息无差异（补充表3）。

老年烧伤患者在HorvathAge年增加了5.82年（95%置信区间，2.25-9.39;P= 2.80×10-3），8.16 GrimAge 年（95% CI，3.72-12.59;P= 9.03×10-4），9.86表龄年份（95% CI，3.49-16.22;P= 4.31×10-3），以及1.46辆但尼丁邮政阿姆地区犬（95%置信区间，0.81-2.11;P= 8.71×10-5），与健康老年人对照组相比（见图3B）。相比之下，年轻成年烧伤患者的表观遗传年龄加速相当于5.54 GrimAge年（95% 置信区间，2.23-8.85;P= 2.21×10-3），6.85表龄年（95%置信区间，2.78-10.92;P= 2.13×10-3），以及1.01名但尼丁邮政美国标准化（95%置信区间，0.49-1.53;P= 5.32×10-4），与健康成人对照组相比（见图3A）。在年轻烧伤患者中，HorvathAge（+0.01年;95%置信区间，-2.58-2.61;P= 9.92×10-1）未表现出加速度。成人与老年烧伤患者之间的生物年龄差异显著异质性，相对于霍瓦斯时钟（P=0.01）和GrimAge（P=0.04），表明结果的显著变异性归因于年龄间差异（图3A-B）。PhenoAge（P=0.43）和DunedinPoAm（P=0.29）报告无显著异质性。

此外，尽管HorvathAge（+2.54年;95%置信区间，-1.15-6.23;P= 0.19）无显著增加，烧伤使男性表观遗传年龄加速8.56年（95%置信区间，4.35-12.77;P= 2.68×10-4），10.54 表龄年（95% 置信区间，4.80-16.28;P= 8.49×10-4），以及1.79名但尼丁邮政美国分差（95%置信区间，1.12-2.45;P= 4.54×10-6）（图3C）。相反，女性烧伤患者则经历了加速表观遗传衰老3.52 HorvathAge年（95% CI，0.76-6.29;P= 1.69×10-2），6.19 GrimAge 年（95% CI，2.90-9.47;P= 7.14×10-4），7.58 表龄年（95% CI，3.29-11.87;P= 1.37×10-3），以及1.04名但尼丁邮政美国区差异犬（95% CI，0.58-1.50;P= 8.40×10-5）（Fig. 3D）。所有时钟在雄性和雌性之间均无显著异质性（P>0.05）。我们共同证明，烧伤会加速不同年龄组和性别的衰老，证明这一效应在所有烧伤患者中是一致的。此外，雄性与雌性在燃烧后加速无差异;然而，老年人在烧伤后年龄加速明显高于年轻患者。

烧伤增加了患者表观遗传预测的死亡和虚弱风险

除了生物衰老，DNAm评分还可以捕捉共病和疾病结局的风险，如虚弱和死亡率，为未来临床风险提供一瞥。有趣的是，烧伤患者的表观遗传决定的虚弱风险（+0.81 标准差;95% 置信区间，0.52-1.11;P=7.08×10-7）和死亡率（+1.20 标准差;95% CI，0.85-1.55;P=2.31×10-9）显著高于对照组，表明未来残疾和死亡风险显著增加（见图4A-B）。更有趣的是，两者都较小（虚弱MRS：+0.68 SDs;95% CI，0.35-1.00;P=1.16×10-4，死亡率 MRS：+0.93 标准差;95% CI，0.60-1.26;P=5.14×10-7）及大面积烧伤（虚弱MRS：+1.29 SDs;95% CI，0.94-1.63;P=1.69×10-8，死亡率MRS：+2.07 标准差;95%置信区间，1.69-2.45;P=8.30×10-13）会提高死亡率和虚弱的风险（见图4A-B）。此外，我们的研究结果显示，每增加5%的TBSA患者，表观遗传推断的死亡风险增加0.12个标准差（95%置信区间，0.07-0.17;P= 1.81×10⁻⁻），而虚弱风险增加0.07 SDs（95% CI，0.02-0.11;P= 3.73×10−3）（图4C）。这与文献中指出TBSA是烧伤患者残疾和结局的重要预后指标[17， 43]相符，也与我们发现TBSA与表观遗传年龄加速之间存在强烈相关性相符。

此外，调整了年龄作为协变量后，两名男性均为虚弱MRS：+0.82;95%置信区间0.33-1.30;P=1.91×10-3，死亡率MRS：+1.22;95%置信区间，0.65-1.79;P=1.46×10-4）及女性（虚弱MRS：+0.80;95% CI，0.45-1.15;P=7.41×10-5，死亡率MRS：+1.17;95% CI，0.75-1.59;P=3.98×10-6）显示出类似的表观遗传确定死亡和虚弱风险增加（图4A-B）。同样，两位老年人（虚弱MRS：+0.94;95% CI，0.43-1.45;P=8.70×10-4，死亡率MRS：+1.59;95%置信区间0.99-2.19;P=7.29×10-6）及年轻成人（虚弱MRS：+0.67;95% CI，0.30-1.05;P=1.08×10-3，死亡率MRS：+0.85;95% CI，0.45-1.25;P=1.93×10-4）显示出烧伤后虚弱和死亡预测风险显著增加（图4A-B）。

更有趣的是，表观遗传预测的死亡和虚弱风险增加似乎随着时间持续存在，就像我们观察到的表观遗传年龄加速持续上升一样。事实上，预测的死亡和虚弱风险从烧伤后早期（0-4天;+1.06虚弱MRS标准差;P虚弱<0.01，死亡率-0.05，MRS服务障碍;P死亡率<0.0001）至后续时间点（28+天;+1.36虚弱MRS标准差;P虚弱<0.0001，死亡率+0.94，MRS服务病;P死亡率<0.0001）（图4D-E）。综合来看，我们的结果显示，烧伤会以剂量依赖性的方式提高表观遗传预测的死亡和虚弱风险，无论年龄和性别如何，这种增加可持续长达28天。

烧伤加速小鼠的表观遗传衰老

最后，我们利用成熟的小鼠热损伤模型，研究烧伤与生物衰老之间的因果关系。鉴于老年人烧伤患者最易受烧伤衰老影响的影响，我们选择了老年小鼠进行甲基化研究。通过比较烧伤前与受伤后七天采集的匹配血液样本（相当于约280人类日），我们观察到，根据汤普森时钟（P = 0.054）烧伤，小鼠衰老加速了3.99周（P = 10-3），根据王时钟（P = 1.7 × 10-3）（图5B-C）加速了小鼠周数 3.99 周).调整了抽血间隔七天后，烧伤根据汤普森时钟（P = 0.094）加速了小鼠3.22周（P = 0.094），按王时钟（P = 3.0 × 10-3）加速了7.40周。这分别对应2.5年和5.8人的衰老年，与我们患者群体中观察到的加速衰老相符。