烧伤引起的回肠肌收缩能力受损与细胞外基质成分增加相关惠好安康烧伤康复

摘要

引言：

严重烧伤会导致胃肠道活动明显受损，如胃排空延迟以及大肠肠易病。然而，这些病理变化的细胞机制仍然大多未知。

方法：

雄性斯普雷格·道利大鼠约3个月大，体重300–350克，被随机分配接受60%全身表面积全层灼伤或假手术，并在手术后24小时内被宰杀。测量了胃排空、胃窦收缩力、回肠平滑肌收缩力和结肠收缩力。从回肠节分离出外肌，制备用于Western Blot分析的平滑肌蛋白提取物。

结果：

与假对照组相比，烧伤大鼠的前窦肌、回肠肌和结肠平滑肌条带的基线节律收缩活动受损。同时，我们的数据显示，烧伤大鼠的回肠肌、ECM蛋白、纤维内联素和层联蛋白显著上调，而假大鼠则更为显著。TGF-β信号是ECM蛋白表达的重要刺激因子。我们的结果显示，TGF-β信号在烧伤大鼠的回肠肌中被激活，表现为Smad2/3表达的激活和磷酸化。此外，平滑肌细胞中ECM信号传导的重要下游因子——总和磷酸化的AKT也在烧伤大鼠的回肠肌中上调。值得注意的是，这些变化在结肠和胃组织中未见。

结论：

严重烧伤后纤维化相关蛋白的沉积是小肠运动能力下降的因素。

关键词：胃肠道动力、烧伤、肠麻、肌裂肌、平滑肌

简介

严重烧伤会导致胃肠道整体损伤，从食管到结肠均有变化。临床上，观察到的变化包括胃溃疡、喂食不耐受、腹胀、胃排空延迟和肠易病延长[1–5]。虽然这些效应早已被记录，但尚未明确的病理生理机制。激素变化、积极的液体复苏和交感神经过载都被提出为潜在机制，但抑制这些通路尚未完全消除烧伤后胃肠道功能障碍。[6–8]

纤维化是严重烧伤后多种组织炎症的常见后遗症。纤维化变化在皮肤中清晰可见[9–12]，但也存在于偏远组织中。多项基于人群的纵向研究针对儿童时期遭受严重烧伤的成年人进行了研究，发现与心血管疾病相关的死亡率显著增加[13， 14]，其他研究也将此与初次损伤后5年以上心纤维化的存在联系起来[15]。肝功能也与烧伤后死亡风险密切相关，肝纤维化很可能是导致此过程的机制[16， 17]。

平滑肌细胞的增殖与组织依从性差相关[18， 19]。平滑肌细胞的增殖导致细胞外基质（ECM）蛋白的分泌[20]。反过来，ECM蛋白影响平滑肌细胞的迁移和增殖，形成正反馈回路[20， 21]。在炎症性肠病中，纤维化重塑伴随过量ECM蛋白沉积，导致功能性影响，如结肠动力和吸收功能受损[22， 23]。

鉴于严重烧伤后的炎症状态、其他偏远组织中出现的纤维化以及肠道活动度的整体下降，我们假设严重烧伤后肠道运输量减少部分介导于平滑肌中纤维化相关蛋白的沉积。

方法

动物

所有动物研究程序均遵循美国国立卫生研究院关于实验动物使用的指南，并获得德克萨斯大学医学分校加尔维斯顿分校机构动物护理与使用委员会的批准（协议#1509059）。动物在实验前被允许适应一周，并在研究期间自由获得食物和水。动物保持12：12的明暗循环。所有动物饲养室和手术室的温度保持在~22°C。

采用了60% TBSA全层烧伤诱导的成熟模型[24， 25]。雄性Sprague-Dawley大鼠（300–350克）被给予镇痛药（布洛芬啡，0.05mg/kg，超高剂量）并全身麻醉（异氟醚，3–5%）。大鼠被置于暴露约30%TBA的保护模具中，浸入95°C至100°C的水中诱发烫伤。背部浸入10秒，腹部浸2秒，导致背部和腹部均有30%的TBSA损伤（总计60%的TBSA烧伤）。烧伤后立即给予室温LR溶液（40 mL/kg，单剂量）。假大鼠被给予镇痛药（丁丙诺啡，0.05 mg/kg，超速），随后麻醉（异氟醚，3–5%），置于烧伤模具中，浸泡于自来水中。但因担心液体过载且未增加烧伤后无明显损失，未给予烧伤后复苏剂。大鼠在麻醉恢复期间获得氧气。所有动物在手术后单独安置，并可自由获得食物和水。在假大鼠和烧伤大鼠中，术前与术后状态无显著体重变化。大鼠在烧伤后24小时被人道安乐死（hpb），并采集了血清和组织。

肌肉活动

肌肉活动按照先前报告的方案测量[26–28]。采集结肠、回肠和胃窦的切片。肌肉条被安装在37°C、含有碳酸Krebs溶液的10毫升器官浴中。肌肉条沿肌肉方向安装。肌肉收缩力使用Grass等长力换能器和放大器，配合Biopac数据采集系统（Biopac Systems，Goleta，美国）测量。试纸长度调整至初始张力1g，然后稳定60分钟。对乙酰胆碱（ACh）的收缩反应以15–20分钟为一周期记录。收缩力以AC添加前4分钟曲线下面积（AUC）相较于加入前4分钟的AUC进行测量。每条肌肉条带的AUC与其横截面积进行归一化，计算公式为：湿组织重量（mg）/[组织长度（mm）×1.05（肌肉密度单位mg/mm3）。同时测量从假大鼠和烧伤大鼠分离的条。

胃排空

测量了固体食物的胃排空，如前所述[29]。大鼠在禁食12小时后被宰杀，并有水可用。给动物食用预称的普通饲料颗粒（1.5–2.0克）。所有动物在5至10分钟内食用完食物。餐后90分钟，动物被人道安乐死。采集胃部，取出内容物，晾干48小时后称重。计算胃排空的公式如下：胃排空（%） = （从胃中回收的1个干粮重量/食物摄入重量）×100。

西方免疫墨迹法

结肠、回肠和胃组织均采集于新鲜碳生成的Krebs缓冲液中。通过显微清扫，外侧肌与黏膜/黏膜下层分离。组织被迅速冷冻保存，并在−80°C下保存，直到使用。样本在溶液缓冲液中均质化，并补充蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Sigma-Aldrich）。在12,000克、4°C下旋转15分钟后，收集并用标准免疫印迹法分离上清液蛋白[30–32]。所用抗体包括磷酸化的STAT3 Tyr705（编号#9145）、STAT3（编号#4904）、AKT（编号#4691）、磷酸化的AKT（编号#4060）、MLC2（编号#8505）、磷酸化MLC2（编号#3671）、SMAD2/3（编号#8685）以及来自Cell Signaling（马萨诸塞州丹弗斯）的磷酸化SMAD（编号#9510）。SM22（Cat#ab10135）和钙蛋白抗体（Cat#ab46794）从英国剑桥的Abcam购买。纤维内克素（Cat#SC-6952）、磷酸化PKCα（Cat#SC-12356-R）和PKCα（Cat#SC-208）均从圣克鲁斯生物技术公司（德克萨斯州达拉斯）采购。从Novus Biologicals（科罗拉多州Centennial）购买了Laminin（Cat#NB300–144SS）抗体。α-SMA（Cat#A5228）抗体从Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）购买。胶原蛋白I抗体（猫号#600-401-103）从Rockland（宾夕法尼亚州波茨敦）购买。所有墨迹至少重复了3次。

统计分析

统计分析使用来自GraphPad Software Inc.（加利福尼亚州拉荷亚）的GraphPad Prism 7.0完成。数据以均值±标准误表示，显著性表示如下：*： P<0.05。误差条表示均值的标准误。

选举结果

烧伤后胃肠功能性下降

烧灼后24小时（p<0.01）胃排空率显著下降（见图1a）。在AC浓度为10−3（p<0.01）和10−2（p<0.01）时，胃窦收缩力显著降低24 hpb（见图1b）。同样，对KCl的心体收缩力显著降低24 hpb（p<0.01）。回肠纵向肌肉收缩力在24 hpb时对所有ACh浓度显著降低（10⁻⁁6，p<0.01;10⁻⁻⁻，p<0.01;10⁻⁠，p<0.001,10⁻³，p<0.001;10⁻²，p<0.05）（见图1c）。结肠环肌收缩力在24 hpb时ACh浓度大于10⁻⁻（10⁻⁻，p<0.05;10⁻⁸，p<0.05,10⁻³，p<0.05;10⁻⁹，<0.05）（见图1d）。

先天平滑肌收缩的标志

钙注素是平滑肌中肌球蛋白ATP酶活性的抑制剂，在回肠肌中显著升高，达到24 hpb（p<0.05）（见图2a）。结肠钙粉嫩表达未见显著变化。SM22是一种与钙基宁相关的蛋白，特异性表达于成人平滑肌中，在胃组织和结肠组织中未表现出显著变化（见图2b）。肌球蛋白轻链（MLC）的磷酸化使平滑肌收缩开始。回肠组织中磷酸化MLC、总MLC或磷酸化与总MLC比例（24 hpb）无显著变化（见图2c）。蛋白激酶C（PKC）是平滑肌收缩的中枢调节因子。结肠组织中磷酸化PKC显著减少，24 hpb（p<0.01）（图2D）。结肠组织中磷酸化与总PKC的比例未见显著变化。胃窦在磷酸化PKC、总PKC或磷酸化与总PKC的比率方面无显著变化。

烧伤后胃肠道组织的炎症

信号引导和转录激活因子3（STAT3）是一种炎症介质。回肠组织中磷酸化STAT3在24hpb时显著升高（p<0.05）（见图3a）。总STAT3水平及磷酸化与总STAT3的比率无显著变化。在胃窦和结肠中，磷酸化STAT3未见显著变化（见图3b）。SMAD 2和SMAD 3是转化生长因子β（TGFß）受体的几个主要信号转导蛋白。磷酸化的SMAD2在回肠组织中显著升高24 hpb，磷酸化与总SMAD2的比例显著升高，为24 hpb（p<0.05）（见图3c）。相反，磷酸化的SMAD3在回肠组织中显著升高24 hpb（p<0.05），磷酸化与总SMAD3的比值显著升高。

烧伤后胃肠道组织中纤维化相关蛋白沉积

ECM蛋白如胶原蛋白I、纤介素和层联蛋白的过度沉积是纤维化发展的标志。回肠肌24 hpb的胶原蛋白I表达显著升高，纤维素表达显著升高（p<0.05）（见图4a）。回肠肌的拉米蛋白也显著升高24 hpb（p<0.05），而结肠组织无显著变化（见图4b）。

蛋白激酶B，也称为AKT，在磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-AKT通路中起着核心作用。该通路的激活导致纤维化相关蛋白在平滑肌中沉积。回肠肌24的磷酸化AKT水平显著升高（p<0.05）（图4c）。结肠组织中磷酸化AKT、总AKT或磷酸化与总AKT的比率未见显著变化。

讨论

我们的研究表明，胃肠道运动的整体下降最早在烧伤后24小时内就已显现。此外，我们的数据表明，这不太可能是胃窦、回肠或结肠的先天平滑肌抑制所致。我们的研究首次证明回肠存在较大的炎症负荷，导致纤维化相关蛋白随后沉积于回肠肌。这些变化在胃和结肠中不存在，表明烧伤后肠道运动能力下降的发病机制在这些独立组织中是不同的。

严重烧伤导致胃排空、胃窦收缩力、回肠收缩力和结肠收缩力显著下降。这与其他研究一致，这些研究也显示烧伤后肠道运输的整体减少[6]。烧伤后6小时内胃排空率下降37–42%[7， 33， 34]。同样，小肠运动在6小时内下降24–42%，结肠活动力下降约34%[35， 36， 34]。

我们的结果显示，回肠肌钙平显著增加，结肠中磷酸化PKC显著减少。然而，所有测量的其他因素，包括MLC和SM22，均未因烧伤显著变化。这些因素密切相关，我们怀疑平滑肌激活通路的先天抑制在烧伤后肠道运输减少的发病机制中并不起主要作用。Calponin和SM22属于平滑肌中分化决定因子的一类。钙粉嫩和SM22在所有平滑肌细胞群体分化过程中同步出现[37]。钙基宁的活化也被认为通过PKC依赖的通路[38]。PKC和MLC的磷酸化在平滑肌收缩的激活或抑制中起着核心作用[39–41]。因此，真正抑制这些通路很可能产生比我们观察到的更强有力的反应。

关于烧伤后肠道运输延迟的竞争理论包括交感神经过载和肠道水肿[6–8]。然而，我们的结果与之前的假说并不完全一致。烧伤后进行积极复苏会导致肠道水肿，通过减少MLC磷酸化降低肠道收缩活动[42]。PKC的磷酸化和激活被认为与平滑肌收缩的交感神经刺激有关[43]。如果磷酸化PKC和MLC水平没有明确变化，交感神经刺激或肠道水肿不太可能单独导致烧伤后肠道运动功能的临床变化。

严重烧伤后典型地会出现大量炎症。我们的结果显示，回肠组织中磷酸化STAT3显著增加，SMAD 2/3活化。然而，结肠或胃组织中STAT3未见显著变化。STAT3在肠道炎症中起双重作用。STAT3通过在上皮细胞和骨髓细胞中的作用，在肠道黏膜中具有保护性和抗炎作用，而在T细胞中作用时则促进炎症[44]。与STAT3类似，SMAD 2/3和TGFß可通过促进肠道形态和屏障功能在压力后恢复，发挥保护作用[45， 46]。树突状细胞介导肠道免疫耐受。与回肠树突状细胞相比，其促炎细胞的比例较低，这很可能是对结肠中较大细菌负荷的适应[47]。回肠在先天免疫中的作用[48]也可能促使回肠在烧伤后更容易受到炎症影响。

炎症是纤维化的常见前兆[49]。肠道炎症会导致肌纤维母细胞激活并增加ECM蛋白的生成[50]。我们的结果显示，烧伤后24小时，回肠肌纤维内联素和层联素表达显著增加。回肠肌还显著增加了AKT磷酸化，这是PI3K-AKT通路的关键组成部分[51]。PI3K-AKT通路被认为与平滑肌纤维化的发展有关。虽然本研究未采集组织学标本，但烧伤后纤维化相关蛋白的沉积可能非常迅速，如心脏组织中所示[52]。虽然以往的研究主要关注烧伤诱发炎症对肠道黏膜的作用[6]，但我们的研究首次证明这些变化也不利于回肠肌，并很可能促成烧伤后肠道通行减少。

结论

严重烧伤后炎症状态介导的纤维化变化是小肠运动能力下降的因素。然而，尽管烧伤后无动力性肠瘤具有整体性，这些变化在胃组织或结肠组织中并未出现。这表明小肠中观察到的变化可能代表着一种独特的潜在病理生理机制。

摘要

引言：

方法：

结果：

结论：

简介

方法

动物

肌肉活动

胃排空

西方免疫墨迹法

统计分析

选举结果

烧伤后胃肠功能性下降

图1——

先天平滑肌收缩的标志

图2 –

烧伤后胃肠道组织的炎症

图3 –

烧伤后胃肠道组织中纤维化相关蛋白沉积

图4——

讨论

结论