动物护理与疤痕形成

所有实验均使用雌性红杜洛克猪，按照俄亥俄州立大学动物机构护理与使用委员会批准的方案（Protocol #2014A00000072）进行。麻醉始于Telazol（新泽西州弗洛勒姆公园Zoetis），并用异氟醚维持。剃须后，交替使用2%氯己定和70%异丙醇（俄亥俄州哥伦布Butler Schein）洗涤背侧躯干。在受伤前，猪的两侧纹有一个1x1厘米的网格，以追踪皮肤表面积随时间增加的情况。热损伤被用来制造全层皮肤缺损，因为此前报道猪皮疤痕在烧伤中加重，且更接近人类肥厚型瘢痕，而非切除伤疤[13]。为了制造全层烧伤，一根1英寸×1英寸的定制金属针[14]被加热至200°C，并对准猪的两侧（N=4个猪）持续40秒。烧伤痂被切除，伤口床用Zimmer空气皮肤膜（印第安纳州华沙Zimmer）从背部采集并以1.5：1比例进行网格移植。生理盐水浸泡的外科海绵（Hydrasorb，Carwild® Inc.康涅狄格州新伦敦）被填入伤口，并用无菌氨纶和皮肤订书钉固定（亨利·谢因，纽约梅尔维尔）。在猪背上形成了玻璃纤维模具（3M Helathcare，明尼苏达州圣保罗），以保护正在愈合的伤口。演员阵容由VetrapTM（3M Healthcare）和Elastikon®（新泽西州新布伦瑞克强生）共同主持。NOVAPLUS芬太尼贴片（Watson Pharmaceuticals， INC，新泽西州帕西帕尼）用于疼痛管理，并在受伤后3天取下。移植后一周，绷带和枕套被取出。

施加与去除压力

通过定制的可调节压力衣（Powernet;Darlington Fabrics，纽约，纽约）用魔术贴™制造，以便调节压力。选择Powernet织物是因为此前已被证明在一定周长减小下，其疲劳程度较低，施加压力水平较高，优于Dri-Tek Tricot织物[15]。移植后一周内开始施加压力，并维持在伤口上方20毫米汞柱。使用聚氨酯泡沫确保凹陷处压力均匀，压力通过菊姬压力传感器（澳大利亚墨尔本MediGROUP）进行测量。每天检查衣物下方及疤痕正上方的压力，如果未达到目标20毫米汞柱，则调整。每三天，衣物会被脱去，换上刚洗净的衣物。创口形成17周后，一半压力处理伤口释放压力，另一半维持12周，形成三个治疗组：对照组（实验期间无施加压力）、连续压力组（移植后1周内施加压力，总计维持29周）和释放压力组（移植后1周内施加压力17周， 然后在最后12周内被移除）。每头猪包含治疗组和对照组，部位随机分配（每组N=8处疤痕）。

疤痕区域

烧伤切除后及移植后1、3、5、11、17、21、25和29周时，使用透明薄膜描绘疤痕边界（每组每时间点8个）。描图用尺子在视场内扫描，导入ImageJ，并量化疤痕面积。每个时间点的面积被归一化为该疤痕在初始时间点（切除后第0周）的面积，以获得每个疤痕的百分比面积。报告平均值的±面积（SEM）。猪的生长是通过使用纹身网格追踪表面积的增加来计算的。在每头猪的每个时间点测量六个面积，最初为1×1厘米，归一化为该方形的第0周面积，并对其进行平均，以获得因猪只生长而增加的表面积百分比。

疤痕粗糙度

疤痕表面粗糙度通过十点平均粗糙度（Rz）进行量化。在疤痕上涂抹了Aquasil Ultra XLV牙科印模材料（DENTSPLY Caulk，特拉华州米尔福德），以制造疤痕表面地形的负印象（或模具）。第17周和第29周的模具（每组n = 8个）填充了Phase2Gel牙科海藻酸盐（Accu-Cast Dental，Bend，俄勒冈州），以对疤痕表面产生积极印象。海藻酸盐被去除并切成切片。切片的横截面在视野内用尺子成像，并将图片导入ImageJ。Rz通过测量每次描摹中最大5个峰的深度并进行平均得到。使用了三个代表性的剖面，并对每个疤痕进行平均值。报告了SEM的平均Rz±

疤痕高度

还使用第17周和第29周的模具测量疤痕体积（每组n=8个，第29周连续压力组因霉菌变形过于扭曲，无法获得可靠体积测量）。负模型被填充Phase2Gel牙科藻酸盐，直到与周围未受伤皮肤水平齐平。模具填充前后称重。根据重量差异计算体积，利用牙科藻酸盐的密度计算体积。通过将疤痕体积除以当时疤痕面积，计算未受伤皮肤以上的平均高度。对于低于周围正常皮肤水平的疤痕，则创建模具的阳性复制品。模具周围用快速干燥的丙烯酸乳胶（DAP Products， Inc，巴尔的摩，马里兰州）包围，以包含疤痕及周围正常皮肤。密封胶干燥后，将铸造树脂（Alumilite Corp. Kalamazoo， MI）倒入模具中并使其硬化。所得的正树脂模具随后被称重，填充海藻酸盐，再次称重，以获得正常皮肤表面以下的负面积皮肤。将该体积除以当时疤痕面积，即可得出疤痕表面距离周围正常皮肤的高度。这些距离以SEM±正常皮肤的平均瘢痕高度报告。

疤痕生物力学

在受伤后第17周（释放组中移除PGT之前）和最后一个时间点（第29周），使用扭转弹球仪（Dia-Stron， Inc.;新泽西州克拉克斯堡）评估了体内生物力学。球状计从已知距离k处投放一个小探针到皮肤上，测量探针的反弹弹跳直到停下。探针最初穿透皮肤的过程，或称凹陷（mm），可以作为皮肤硬度的衡量标准。皮肤越软、越有弹性，探针穿透得越深，凹陷越大。k值在1.15到1.45毫米之间被认为可靠，因此除压力释放组n=6外，所有时间点的k值均为n=8。报告了SEM±平均缩进。

疤痕形态

在第17、21、25和29周，对疤痕采集了6毫米活检进行冷冻切割。每次活检均沿颅尾方向在疤痕上画一条线，以确保所有样本切片方向一致。活检的一半进行快速冷冻，另一半准备进行组织学分析。首先对活检进行横切面切片，以评估整体组织结构。为检查胶原蛋白取向，随后通过粗切片从冷冻组织中取出表皮，面部切片于7微米处，切片时用血液素和伊苏蛋白染色（见图1）。在真皮-表皮交界处下方60–75微米处采集了与每张图像顶部对齐的组织背轴的切片（每组每时间点取6个样本）。在第17周和第29周，采集了额外的活检穿孔，固定在10%福尔马林中（Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州），持续72小时并嵌入石蜡中。样品在10微米切片，并用Masson's Trichrome（Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州）和Picrosirius Red（Electron Microscopy Sciences，Electron Microscopy Sciences，Hatfield，宾夕法尼亚州）染色，以观察瘢痕形态。使用了一台偏振光学显微镜（Zeiss Axioskop Widefield LM，德国奥伯科亨）用于成像带有皮克罗西里乌斯红染色的切片。

统计数据

采用了单向方差分析（ANOVA）与Tukey's事后检验（JMP，SAS研究所，北卡罗来纳州凯里）进行。在两两比较中，进行了学生的t检验。猪的识别被阻断以产生随机效应，统计显著性在p< 0.05处被考虑。

疤痕外观

压力处理使疤痕平滑且收缩更小，相较于对照疤痕变得粗糙且拉长（见图2）。第17周后放松压迫后，疤痕变得收缩、粗糙且隆起，类似于对照时期的疤痕。在整个实验过程中受到压力的疤痕保持平滑外观，形状更接近原始方形伤口。

疤痕面积被量化为疤痕收缩程度的指标。从第3周到第17周，接受PGT的疤痕面积显著大于对照组，但明显小于正常皮肤（p < 0.001，见图3）。到第17周，接受PGT的疤痕平均占原始伤口面积的148%，而对照组疤痕平均为100%。注意，第17周未受伤皮肤面积平均为原始面积的230%，这是由于每只动物的显著生长，因此所有疤痕都表现出显著收缩。当压力被移除时，瘢痕迅速收缩，在压力移除四周后，释放压力组的面积明显小于连续压力组，分别为142%和176%。在研究其余部分，连续压力组的瘢痕面积显著大于释放压力组和对照组（p < 0.05），且对照组与释放压力组之间的瘢痕面积无统计差异。

加压治疗的疤痕显著降低了瘢痕高度和Rz（表面粗糙度），相比对照组（p < 0.01;图4和图5）。接受PGT的疤痕通常低于周围正常皮肤的高度，且光滑，而对照组的疤痕则比正常皮肤高出约1毫米，且较粗糙。压力释放组的压力被移除后，疤痕高度增加（p < 0.001），变得更粗糙，与对照组相似，而连续压力组保持光滑且高度降低。

生物力学

压迫治疗使瘢痕平均更柔韧，表现为球状计探针的凹陷程度增加（见图6）。压力消除后，释放压力组的柔韧性显著下降（p < 0.01），而连续压力组和对照组的柔韧性保持相对稳定。到最后一个时间点，连续压力组的内弯显著更大，因此柔韧性也更高，相较于释放压力组和对照组（p < 0.01）。

疤痕形态

三色染色的组织学切片显示，第17周对照瘢痕中的胶原蛋白基质（蓝色染色）较接受PGT的瘢痕更厚、更致密（见图7）。压力处理疤痕显示真皮中含有更多细胞质（红色染色）的部分，相较对照瘢痕。到第29周，所有处理组的胶原蛋白含量和密度均增加，颜色较深蓝色，尽管释放组和对照组的瘢痕基质密度较持续受压的瘢痕更为致密。

第17周的Picrosirius红染色显示，对照组的胶原纤维通常较粗，而压力处理组中与疤痕表面平行排列的胶原纤维较细（见图8）。第29周时，连续压力组的纤维依然细且平行，而释放压力组的纤维变得更粗。对照组的纤维厚度也从第17周增加到第29周。疤痕的正面切片显示，PGT治疗的瘢痕中纤维呈交叉阴影排列，而对照瘢痕内的胶原蛋白则高度排列于背腹方向（见图9）。在释放压力组停止PGT后，释放后4周内胶原蛋白排列显著增加，纤维主要呈背腹方向，类似对照组。第29周时，释放组和对照组的比对仍被观察到;但由于纤维厚度增加，这一部分略微被遮蔽（见图9）。